S'appuyant sur le succès de l'A6GCS/53 de deux litres, Maserati entama la création d'une voiture de sport à moteur plus puissant, capable de remporter des victoires incontestables dans le nouveau championnat mondial des voitures de sport. L'A6GCS/53 avait été un véritable succès, tant sur la piste que commercialement. Ainsi Maserati souhaitait rééditer la réussite de l'A6 en créant une machine à la fois très rapide mais aussi assez facile à utiliser et à entretenir par les nombreux clients du constructeur italien.

À l'époque, le moteur le puissant disponible à l'époque était le six cylindres en ligne de 2,5 litres équipant la 250F de Grand Prix. En 1954, une voiture de développement fut équipée de ce dernier, adapté pour fonctionner avec de l'essence ordinaire. Toutefois, il n'était tout simplement pas assez puissant pour rivaliser avec les derniers moteurs Ferrari et Jaguar. Les premières tentatives de modification du moteur en augmentant la course ont abouti à une version 2,8 litres, mais toujours pas assez puissante. Les ingénieurs ayant tiré le maximum du bloc, ils se sont donc tournés vers une autre solution. Ils se sont donc lancer dans la réalisation d'une version légèrement plus grande du moteur.

D'une cylindrée d'un peu moins de 3 litres, le nouveau moteur 300S a conservé la même course de 90 mm que le 2,8 litres testé précédemment, mais avec un alésage plus large de 84 mm. Le moteur entièrement en aluminium fut doté d'une double culasse à arbre à cames en tête. Sous sa forme originale, le nouveau six cylindres en ligne était équipé de trois Weber de 42 mm, et plus tard dans sa carrière, des exemplaires de 45 mm furent montés et même l'injection directe de carburant fut testée. Fonctionnant à l'essence ordinaire, la 300S était capable de produire une puissance de 245 ch. Avec des carburateurs de 45 mm, elle pouvait produire environ 260 ch.

Le moteur étant en cours de développement, l'attention s'est ensuite portée sur le châssis qui abriterait le six cylindres en ligne. Très moderne, il s'agissait d'un châssis tubulaire complexe, qui combinait des tubes ovales et ronds de petit diamètre. Bien que sa construction demanda beaucoup de temps, ce châssis tubulaire était à la fois plus léger et plus solide que les châssis traditionnels. Les toutes premières 300S ont été construites dans l'usine Maserati, mais le travail, qui exigeait beaucoup de main-d'œuvre, a ensuite été sous-traité à la société spécialisée Gilco de Gilberto Colombo.

La suspension était assurée par des doubles bras triangulaires à l'avant, avec des ressorts hélicoïdaux montés verticalement sur les amortisseurs. À l'arrière, un essieu DeDion sophistiqué fut monté, avec un ressort à lames semi-elliptique transversal et des amortisseurs hydrauliques. La boîte de vitesses transversale était montée en même temps que le différentiel, ce qui ajoutait un peu plus de charge aux roues arrière. De gros tambours à ailettes fournissaient à la 300S une puissance de freinage suffisante. Comme précédemment pour les A6GCS/53 et 250F, Medardo Fantuzzi a été chargé de la conception et de la construction de la carrosserie en aluminium.

Prête pour le début du championnat du monde 1955, la 300S, relativement légère et agile, fut engagée par l'usine ainsi que par des privés. Les trois premières voitures ont immédiatement été expédiées aux États-Unis où elles ont été pilotées par Briggs Cunningham et ses pilotes. Les débuts furent prometteur, les Maserati se classant troisième et quatrième aux 12 heures de Sebring. Malheureusement, ce fut un fait rare dans ce qui fut une première saison difficile pour la nouvelle Maserati, car des problèmes de développement ont souvent ralenti les 300S dans leur quête de succès. À la fin de l'année, Juan Manuel Fangio remporta tout de même le Grand Prix du Venezuela.

Le développement de l'auto en interne chez  Maserati et Fantuzzi s'est poursuivit. En 1956, un nouveau museau plus long fut introduit. À l'époque, l'aérodynamique était le moyen le plus efficace de rivaliser avec les grosses cylindrées. La saison s'est avérée meilleure pour la 300S, qui attirait désormais de nombreux clients du monde entier. Stirling Moss et Carlos Menditeguy ont remporté la manche d'ouverture de la saison, les 1000 km de Buenos Aires, et avec Jean Behra, Moss remporta également les prestigieux 1000 km du Nürburgring. Ferrari remporta les trois autres manches, terminant ainsi l'année en tant que nouveau champion du monde.

Pour remédier au manque de puissance intrinsèque de la 300S, Maserati a également expérimenté un moteur V12, mais le développement du six cylindres a finalement été abandonné au profit de la 450S, dotée d'un moteur plus puissant. Avec deux douzaines d'exemplaires construits et vendus, la 300S a certainement été un succès financier pour Maserati. Elle reste aujourd'hui l'une des meilleures voitures de sport à moteur avant, sans doute éclipsée par la Tipo 60/61 Birdcage construite quelques années plus tard. Bien que de plus en plus précieuse, les 300S sont heureusement encore régulièrement engagées lors d'événements historiques dans le monde entier.